Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

Метод ПЦР-диагностики в клинической медицине широко используется во многих областях, включая урогинекологию, неонатологию, службу крови, клинику инфекционных заболеваний, фтизиатрию и пульмонологию.

В урогинекологии, где инфекционные заболевания могут вызвать бесплодие и невынашивание беременности у женщин, метод ПЦР позволяет выявить целый "букет" половых инфекций, включая хламидиоз, микоплазму, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Выявление этих инфекций своевременно помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин. Также метод ПЦР используется для выявления вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, в особенности вирус Герпеса и вирус папилломы человека.

В неонатологии метод ПЦР-диагностики позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.

В службе крови метод ПЦР-диагностики применяется для избежания риска переливания пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты. Этот метод превосходит по точности серологические методы, так как он способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

Клиника инфекционных заболеваний также использует метод ПЦР-диагностики. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия и токсоплазмоз.

В фтизиатрии и пульмонологии метод ПЦР-диагностики позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Кроме того, с помощью этого метода можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР также используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Заметим, что метод ПЦР-диагностики широко используется не только в клинической медицине, но и в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Метод ПЦР-диагностики, несмотря на свою популярность и эффективность, обладает рядом ограничений. Однако, количество этих ограничений настолько незначительно, что не препятствует использованию метода.

Возможно не только амплификация ДНК живых микроорганизмов, но и погибших. Используя ПЦР-диагностику для контроля эффективности лечения, необходимо соблюдать определенные правила. В первую очередь, проводить анализ нужно после определенного промежутка времени (1-2 месяца), за который происходит полное исчезновение возбудителя инфекции из организма.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Подбор фрагментов ДНК (праймеров) основывается на генетическом строении конкретного микроорганизма. Теоретически, такой же фрагмент может присутствовать и у других микроорганизмов, геном которых на сегодняшний день еще не расшифрован, что может привести к ложноположительному результату анализа.

Также, изменчивость микроорганизмов может создать проблемы в процессе ПЦР-анализа. Эта способность возбудителей к мутации порой приводит к неуловимости некоторых штаммов в процессе анализа.

Однако, для уменьшения рисков, были разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com